25. 某种类型的白血病由蛋白 P 引发,蛋白 UBC 可使 P 被蛋白酶识别并降解,药物 A 可通过影响这一过
程对该病起到治疗作用。为探索药物 A 治疗该病的机理,需构建重组载体以获得融合蛋白 FLAG-P 和
FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的 P,FLAG 是一种短肽,连接在 P 或 P△的氨基端,使融合蛋白
能与含有 FLAG 抗体的介质结合,但不影响 P 或 P△的功能。
(1)为构建重组载体,需先设计引物,通过 PCR 特异性扩增 P 基因。用于扩增 P 基因的引物需满足的条
件是_______、为使 PCR 产物能被限制酶切割,需在引物上添加相应的限制酶识别序列,该限制酶识别序
列应添加在引物的______(填“3'端”或“ 5'端”) 。
(2)PCR 扩增得到的 P 基因经酶切连接插入载体后,与编码 FLAG 的序列形成一个融合基因,如图甲所
示,其中“ATGTGCA”为 P 基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后,融合基因转录出的 mRNA
序列正确,翻译出的融合蛋白中 FLAG 的氨基酸序列正确,但 P 基因对应的氨基酸序列与 P 不同。据图甲
分析,出现该问题的原因是______。修改扩增 P 基因时使用的带有 EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问
题,具体修改方案是______。
(3)融合蛋白表达成功后,将 FLAG-P、FLAG-P△、药物 A 和 UBC 按照图乙中的组合方式分成 5 组。
各组样品混匀后分别流经含 FLAG 抗体的介质,分离出与介质结合的物质并用 UBC 抗体检测,检测结果
【
如图丙所示。已知 FLAG-P 和 FLAG-P△不能降解 UBC,由①②③组结果的差异推测,药物 A 的作用是
______;由②④组或③⑤组的差异推测,P△中缺失的特定序列的作用是______。
(4)根据以上结果推测,药物 A 治疗该病的机理是______。
(1) ①. 两种引物分别与两条模板链3'端的碱基序列互补配对; (2) 5'端 (2) ①. 在转录出的 mRNA 中, 限制酶识别序列对应的最后两个碱基与P 基因对应的第一个碱基构成 一个密码子,导致读码框改变,翻译出的氨基酸序列改变。 ②. 在 EcoRⅠ识别序列前后增加碱基,使其碱基数目加上 FLAG 的碱基数目为 3 的倍数; (3) ①. 促进 UBC 与 FLAG-P 的结合 ②. P△中缺失的特定序列是与UBC 结合的关键序列; (4) 药物 A 促进 UBC 与 FLAG-P 的结合,从而促进蛋白 P 被蛋白酶识别并降解,达到治疗的目的